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              實驗提取質(zhì)粒DNA方法
              點擊次數(shù):1513 更新時間:2019-12-27

              提取質(zhì)粒DNA的方法有很多種,從提取產(chǎn)量上分可分為微量提取、中量提取、大量提取,從使用儀器上分可分為一般提取和試劑盒方法提取,從具體操作方法分可以分為堿裂解法、煮沸法、牙簽法等,各種不同的方法各有其優(yōu)缺點,根據(jù)不同的實驗目的可以采用合適的提取方法。

              堿裂解法:人們使用堿與SDS裂解法從E. coli(大腸桿菌)中分離制備質(zhì)粒DNA已有30多年的歷史。將細菌懸浮液暴露于高pH值的強陰離子洗滌劑中,會使細胞壁破裂,染色體DNA和蛋白質(zhì)變性,將質(zhì)粒DNA釋放到上清中。盡管堿性溶劑使堿基配對*破壞,閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雙鏈仍不會彼此分離,這因為它們在拓撲學上是相互纏繞的。只要OH-處理的強度和時間不要太過,當pH值恢復到中性時,DNA雙鏈就會再次形成。

              質(zhì)粒DNA煮沸法:是將細菌懸浮于含有Triton X-100和能消化細胞壁的溶菌酶的緩沖液中,然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細菌外壁,還有助于解開DNA鏈的堿基配對,并使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性。但是。閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈彼此不會分離,這是因為它們的磷酸二酯骨架具有互相纏繞的拓撲結(jié)構。當溫度下降后,閉環(huán)DNA的堿基又各就各位,形成超螺旋分子,離心除去變性的染色體DNA和蛋白質(zhì),就可從上清中回收質(zhì)粒DNA。煮沸裂解法對于小于15kb的小質(zhì)粒很有效,可用于提取步至lmL(小量制備),多至250mL(大量制備)菌液的質(zhì)粒,并且對大多數(shù)的大腸桿菌菌株都適用。
              質(zhì)粒小提試劑盒:用于大腸桿菌中質(zhì)粒DNA的小量提取,它結(jié)合了優(yōu)化的堿裂解法,以及方便快捷的硅膜離心技術,具有高效,快捷的特點,能在30min內(nèi)完成全部操作。利用試劑盒能從1-5mL過夜培養(yǎng)的大腸桿菌菌液中純化得到10-40μg高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA(OD260/OD280=1.7-1.9),此質(zhì)粒DNA可直接用于DNA序列分析,各種酶促反應,PCR以及部分細胞系的轉(zhuǎn)染等。

               

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