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              活性蛋白試劑盒提取操作步驟
              點擊次數(shù):928 更新時間:2022-04-19

              本試劑盒用于從哺乳動物組織和培養(yǎng)細胞中提取具有活性的全蛋白, 用含有蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液

              Lysis Buffer 勻漿裂解組織或細胞,作用溫和,提取過程簡便。獲得的全蛋白可用于 Western Blot、免疫共沉淀和酶 的活性的測定的等后續(xù)研究,但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀的研究,因本試劑盒中包括這兩種酶的抑制劑。 應用方面:可用于 Western Blot、免疫共沉淀和酶活性測定等后續(xù)研究。

              操作步驟

              Ⅰ、實體組織蛋白的提取

              1、在每 mL 冷 Lysis Buffer 加入 10 μL 磷酸酶抑制劑,1 μL 蛋白酶抑制劑和 10μL PMSF,混勻。冰上保存數(shù)分鐘待 用;

              2、 每 100mg 固體組織置于培養(yǎng)皿中,手術(shù)剪剪碎成 3mm×3mm 左右的小塊,加入 0.5~1 mL 冷 Lysis Buffer,玻 璃勻漿器上下手動勻漿 15 次,注意低溫操作;

              3、取組織勻漿液轉(zhuǎn)移到 1.5mL 預冷的離心管,離心 10000 轉(zhuǎn)/分,4℃離心 5 min;

              4、取上清轉(zhuǎn)移至新的預冷的離心管中,即為全蛋白提取物,蛋白定量(Bradford 法、BCA 法);

              5、分裝保存于-70℃,避免反復凍融。


              Ⅱ、培養(yǎng)細胞蛋白提取

              1、 貼壁培養(yǎng)的細胞,吸去培養(yǎng)基后,加入 10mL/150mm 培養(yǎng)板的冷 PBS 洗兩次,每次振搖數(shù)次以盡量去除培養(yǎng)液;

              2、  懸浮培養(yǎng)的細胞或用細胞刮子刮下的貼壁細胞,將細胞及培養(yǎng)液移至離心管中,1000 轉(zhuǎn)/分離心 10 min,再用10mL/150mm 培養(yǎng)板的冷 PBS,1000 轉(zhuǎn)/分離心 5 min 洗兩次;

              3、 在每 mL 冷 Lysis Buffer 加入 10μL 磷酸酶抑制劑,1μL 蛋白酶抑制劑和 10μL PMSF(用戶自配:濃度 100mM, 溶于異丙醇),混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用;

              4、 在上述培養(yǎng)板或離心管的細胞中,加入上述配制好的冷 Lysis Buffer;

              5、冷室或冰上操作,貼壁細胞用細胞刮子刮下,皆 Lysis Buffer 一同轉(zhuǎn)移至新的預冷的離心管中;懸浮培養(yǎng)或裂解前刮下的貼壁細胞皆 Lysis Buffer 一同轉(zhuǎn)移至新的預冷的離心管中;

              6、置于 4℃搖床平臺上,溫和振蕩 15 min;

              7、14,000rpm,4℃離心 15min,取上清為全蛋白提取物, 蛋白定量(Bradford 法、BCA 法);

              8、  分裝保存于-70℃,避免反復凍融。

              注意事項:

              所有接觸樣品的用具及試劑均需預冷。我們在提取蛋白后,如有必要,可透析除去表面活性劑。


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