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              解決PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)假陰性或無擴增產(chǎn)物
              點擊次數(shù):1680 更新時間:2022-05-23

              解決PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)假陰性或無擴增產(chǎn)物(即陽性對照中有條帶,而樣品則無條帶)方法:

                1、條帶放置時間過久,核酸被降解,最好在48h內(nèi)進行電泳檢測。

                2、DNA模板純度低,如含有雜蛋白質(zhì)或Taq酶抑制劑,可對DNA進行再次純化或重新用優(yōu)質(zhì)試劑盒提取DNA; DNA濃度太低時,可以加大模板量;對具有二級結(jié)構(gòu)DNA使用較好的聚合酶;提取DNA時,避免吸入酚類試劑。

                3、對設(shè)計不合理的引物進行重新設(shè)計合成;引物應高濃度小量分裝保存,防止多次凍融而降解失效;檢測引物OD值并進行電泳檢測以確保兩條引物濃度一致。

                4、酶失活時,更換新酶,或新舊兩種酶同時使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。

                5、PCR反應條件:提高變性/退火溫度;適當增加循環(huán)次數(shù)。

                6、Mg2+濃度過低可影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗,而Mg2+濃度過高會降低PCR的特異性,因而可適當提高Mg2+濃度。

                7、如果靶序列發(fā)生突變或缺失時,也會影響引物和模板的特異性結(jié)合,產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

                Q3:非特異性條帶擴增或者條帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象

                Answer:

                1、當引物特異性差或引物形成二聚體時,可重新設(shè)計引物或者使用巣式PCR

                2、若模板或引物濃度過高,可適當降低模板或引物濃度

                3、酶量過多,則適當減少酶量

                4、Mg2+濃度偏高,則降低鎂離子濃度

                5、退火溫度偏低,適當提高退火溫度或使用二階段溫度法(94變性,65左右退火與延伸)

                6、循環(huán)次數(shù)過多,不僅會降低擴增效率,且會使錯誤摻入率增加,因此需要減少循環(huán)次數(shù)。


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