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              PCR反應(yīng)DNA 復(fù)制過程解讀
              點擊次數(shù):215 更新時間:2025-01-21

                     PCR全稱多聚酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction),是一種非常強大的技術(shù),可以通過一種非常簡單但是高效的方法來復(fù)制DNA,它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。
              復(fù)制DNA必要性:
              DNA復(fù)制是很多研究的基礎(chǔ),例如,當我們對RNA進行測序時,必須先將RNA轉(zhuǎn)化為DNA,并進行大量復(fù)制。在對于某個人進行基因組測序時,我們不能對于某個細胞或者單個分子進行測序。測序的基礎(chǔ)要求擁有大量的相同的DNA分子拷貝,因此,DNA復(fù)制是做生物研究中的基礎(chǔ)工具。那么怎么獲取這么多拷貝呢?PCR正是一個復(fù)印機一般的存在,利用DNA的幾個特性,成為批量復(fù)制DNA的方法。

              PCR原理及步驟:
              說到原理,我們就要回顧一下DNA結(jié)構(gòu):

              DNA分子兩條單鏈以雙螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)成,DNA兩條鏈擁有自行粘附的特性,A與T配對,C與G配對,DNA粘附特性是PCR的核心原理。同時DNA復(fù)制時也是具有方向性的,DNA序列的開始端稱為5‘端,末端稱為3’端。
              在復(fù)制時,需要加入一種叫做引物(primers)的東西。可以將引物理解為一個短序列,下圖中紅色的部分就是引物。引物通常15到20個堿基,可以短一些,也可以長一些。但是必須和我們想合成的DNA片段成互補關(guān)系。將引物與DNA鏈混合時,會自動粘在上面,因為他們是互補的。引物獲得可以從公司訂購,后續(xù)有機會我們也會分享引物設(shè)計方法。

              PCR過程分三步:
              變性--退火--延伸,PCR中會對這三步循環(huán)播放。
              A. 變性

              在開始準備變性的過程中,要慢慢加熱混合物,加熱混合物時,兩條鏈間氫鍵會融化,DNA兩股鏈會分開,就像上圖粉色的部分。如果混合物熱的情況下,引物不會和DNA黏在一起,兩條DNA鏈也不會黏在一起。
              B. 退火
              接下來混合物慢慢的冷卻,這時引物會黏在DNA上,因為引物較小,更容易漂浮起來,和DNA結(jié)合。溫度控制在54攝氏度左右可以保證引物序列和DNA互補配對,而DNA雙鏈不會黏在一起。
              C. 延伸
              這一步我們需要一個幫助DNA復(fù)制的工具,即聚合酶鏈式反應(yīng)中的聚合酶(polymerase)。下圖中綠色的圖形就代表著DNA聚合酶,所到之處萬物生,這也是我們身體各個細胞中用來復(fù)制DNA的工具。聚合酶的作用方式也非常生猛,直接找到部分單鏈,部分雙鏈的地方,咬住那里的序列開始進行復(fù)制。也就是說聚合酶會先找到引物,開始沿著引物進行缺失的序列填充。如下圖中看到的,在一輪填充序列后,引物所在的鏈條(橙色鏈)會被補齊。這一步中會加入As, Cs, Gs和Ts這些DNA原材料,這樣可以把他們整合到新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈。這一步的溫度稍微高一些,大概是72攝氏度。最初我們加入的是雙鏈DNA,在一個周期后,我們會獲得四條鏈,兩個周期后獲得8條鏈,30個周期后,會獲得10億條DNA鏈。

              DNA 復(fù)制所需的基本要素:
                     DNA 的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈 DNA 在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈,在 DNA 聚合酶的參與下,根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發(fā)現(xiàn),DNA 在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈,當溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制 DNA 的變性和復(fù)性,加入設(shè)計引物,DNA 聚合酶,dNTP 就可以完成特定基因的體外復(fù)制,這是 PCR 的理論基礎(chǔ)。PCR 反應(yīng)是在體外模擬 DNA 的復(fù)制過程,因此反應(yīng)體系中必須具有 DNA 復(fù)制所需的基本要素:
              1、模板(template),含有需要擴增的 DNA 片段。
              2、引物(primer),一對引物決定了需要擴增的起始和終止位置。
              3、聚合酶(polymerase ),DNA 聚合酶復(fù)制需要擴增的區(qū)域。
              4、脫氧核苷三磷酸(dNTP),用于構(gòu)造新的互補鏈。
              5、緩沖液(buffer),提供適合聚合酶行使功能的化學環(huán)境。


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