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              產(chǎn)品列表PRODUCTS LIST

              HiFi One-Step RT-PCR Mix(電泳)

              簡要描述:

              HiFi One-Step RT-PCR Mix(電泳)公司正在出售的產(chǎn)品:小鼠纖維原細胞 骨形態(tài)發(fā)生蛋白9封閉多肽 牛布魯氏桿菌PCR檢測試劑盒 大鼠葡萄糖依賴性胰島釋放多肽(GIP)ELISA檢測試劑盒 精氨(Arg)檢測試劑盒 假堅強芽胞桿菌 1號染色體開放閱讀框83抗體

              更新時間:2024-01-12

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              HiFi One-Step RT-PCR Mix(電泳)

              商品屬性:

              產(chǎn)品名稱

              規(guī)格

              貨號

              HiFi One-Step RT-PCR Mix(電泳)

              250T

              A-PJ1036

              6.png


              末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)是一種不依賴于模板的 DNA 聚 合酶,催化脫氧核苷酸結(jié)合到 DNA 分子的 3’羥基端。帶有 突出、凹陷或平滑末端的單雙鏈 DNA 分子均可作為 TdT 的 底物,加尾長度可達 5~300nt。本酶經(jīng)電子重構(gòu)架技術(shù)篩選, 使其可以在 45°C 高溫下反應,從而避免因 DNA 二級結(jié)構(gòu)造 成的加尾效率下降。 該酶廣泛用于 DNA 的 3’末端添加同聚物、利用修飾堿 基(如 ddNTP,DIGdUTP)標記 DNA 3’末端、TdT 介導的 dUTP 缺口末端標記技術(shù)(細胞凋亡的原位檢測)等試驗。

              活性定義:37 ℃ 60 分鐘內(nèi),催化 1nmol dNTP 加入到多聚核苷酸 3’羥基末端中所需的酶量定義為 1 個活性單位
              熱失活:75°C 20min。
              儲存:-20℃ 可保存 3 年。
              注意事項
              1、適量 EDTA 可使 Terminal Transferase 的活性喪失。
              2、金屬離子螯合劑,較高濃度的銨根離子、氯離子、碘例子和磷酸根離子均對 Terminal Transferase 活性具有抑制作用。
              3、DNA 末端 mol 數(shù)的計算,長度為 100bp 的 DNA:1pmol末端 DNA=0.33ng。

              本試劑采用穩(wěn)定高效的 RT-PCR 預混體系,是以 RNA 為模板進行一步法 RT-PCR 的專用試劑。其原理為用基因特 異性引物進行反轉(zhuǎn)錄反應,獲得第一鏈 cDNA(不可使用 Oligo(dT)或 Random Rimer 合成第一鏈 cDNA),再使 用基因特異性正向引物和反向引物進行 PCR 擴增,在同一 反應體系中一步完成從反轉(zhuǎn)錄到 PCR 的全部過程。反應體 系中已含有電泳所需的指試劑(藍色和黃色),反應后可以 直接進行電泳。 在本試劑盒中,將耐熱 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、Rnase Inhibitor、 Hotstart 高 保 真 DNA 聚合酶以及穩(wěn)定劑等配制成 50×One-Step Enzyme Mix 預混液;反應 Buffer、dNTP 以及 電泳指示染料配制成 5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer,因此 使得操作更加簡單便,擴增產(chǎn)物可用于平端克隆和 DNA 測 序。
              主要優(yōu)勢:
              ? 耐熱M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶可在55℃反應能更好的打開復雜二級結(jié)構(gòu),只需 10min 即可完成逆轉(zhuǎn)錄。
              ? DNA 聚合酶為熱啟動型高保真酶,能夠有效的抑制非特異性反應且具有較高的校正活性,酶激活僅需 2min。
              ? 具有寬泛的模板量兼容性,10 ng~1μg 都可有效擴增。
              ? 反應過程中無需開蓋,避免了操作過程中的污染危害。
              組分
              名稱 250T
              50×One-Step Enzyme Mix 100 μl
              5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer 1 ml
              RNase Free H2O 1 ml×3
              儲存:請置于-20°C,可保存 2 年;避免反復凍融。
              注意:
              1.50×One-Step Enzyme Mix 粘度高,第一次使用之前要離心收集至反應管底部,吸取時應緩慢小心。
              2.由于使用了 Hotstart 高保真 DNA 聚合酶,反應配制可在常溫進行,但各組分應-20°C 保存。
              實驗操作和反應條件:
              1. 按以下組分配制反應液
              RNA(病毒 DNA/RNA 樣品直接使用 2~10μl) 10 ng~1 μg
              5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer 4 μl
              50×HiFi One-Step RT-PCR Enzyme Mix 0.4 μl
              基因特異性上游引物(10μM) 0.8 μl
              基因特異性下游引物(10μM) 0.8 μl
              Rnase Free H2O Up to 20 μl
              注意:超過 1 μg 的 RNA 模板量會抑制 PCR 反應,建議第一次可使用 200 ng 的 RNA 模板,然后根據(jù)結(jié)果進行優(yōu)化。
              2. 在 PCR 儀上按以下條件進行 RT-PCR 反應:
              55°C, 10min 逆轉(zhuǎn)錄反應
              95°C, 2min 失活 M-MLV,并激活高保真聚合酶
              95°C, 20s 30~40 cycles
              TM°C, 20s
              72°C ,
              2Kb/min
              72°C, 2min 末端延伸
              3. PCR 反應結(jié)束后,可取 5 μl 產(chǎn)物直接進行電泳檢測。預混液中已經(jīng)包含綠色染料,無需再加入 DNA Loading Buffer。1% Agarose 電泳時,藍色指示劑指示 3~5 kb,黃色指示劑指示<50 bp。

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              PCR 反應需要使用哪些試劑和設(shè)備?

              試劑:
              模板DNA:PCR反應需要模板DNA,如從細胞、組織、血液中提取DNA等;引物:PCR反應的兩個引物,分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域,引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物;dNTPs:PCR反應中需要四種dNTPs,包括脫氧腺苷酸(dATP)、脫氧胸苷酸(dCTP)、脫氧鳥苷酸(dGTP)、脫氧胞嘧啶酸(dTTP),用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程,用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增;Taq DNA聚合酶:PCR反應需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等,用于擴增DNA鏈;PCR buffer溶液:對PCR反應具有緩沖作用,調(diào)節(jié)反應pH,硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛,可增強PCR反應特異性,從而提高反應效率;酶切體系:PCR擴增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實驗步驟,常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準,用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒:用于純化PCR反應產(chǎn)物;
              設(shè)備:
              PCR儀:用于控制反應溫度,保證PCR反應時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴格控制;電泳槽:用于分離PCR擴增產(chǎn)物;核酸提取儀:從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學技術(shù)中均是,只有在有序齊全的基礎(chǔ)上,才能進行PCR反應并得出準確結(jié)果。

              PCR相關(guān)基礎(chǔ)實驗:

              PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環(huán)組成,每個循環(huán)包括以下3個步驟:

              一、變性:

              利用高溫(93-98℃)使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前,通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離,僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘,接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段。

              二、退火或稱接合,復性:

              在DNA雙鏈分離后,降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結(jié)合或者錯誤地結(jié)合。該步驟時間1-2分鐘。

              三、延伸:

              DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr(來自于嗜熱菌Thermus brockianus)約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

              PCR反應條件優(yōu)化:

              1、變性溫度和時間:

              保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s,再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長,可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

              2、復性溫度和時間:

              PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結(jié)合。復性溫度越高,產(chǎn)物特異性越高。復性溫度越低,產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。

              3、延伸溫度和時間:

              一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時,過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合,可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時間,可根據(jù)待擴增片段的長度而定,小于1kb, 1min足夠;大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間。這里需要注意,延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時間。

              4、循環(huán)數(shù):

              其他參數(shù)選定后,PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后,PCR產(chǎn)物的積累即可達到最大值,實際操作中由于每步反應的產(chǎn)率不可能達到100%,因此不管模板濃度是多少,20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多,非特異擴增增加。

              公司正在出售的產(chǎn)品:

              禽正呼腸孤病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

              表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域蛋白7ELISA試劑盒 EGFL7免費代測試劑

              擠奶工結(jié)節(jié)病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

              平尾毛細線蟲PCR檢測試劑盒價格

              脆性組氨三聯(lián)體ELISA試劑盒 FHIT免費代測試劑

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              麥芽香肉桿菌PCR檢測試劑盒

              副流感病毒PCR檢測試劑盒

              單純皰疹病毒抗原2ELISA試劑盒

              貓白血病病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

              馬立克氏病病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

              蛋白3特異性抗中性粒細胞胞質(zhì)抗體ELISA試劑盒

              庫蚊通用探針法熒光定量PCR試劑盒

              禽杯狀病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

              電壓門控鉀通道抗體ELISA試劑盒

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              破傷風桿菌PCR檢測試劑盒

              諾如病毒1PCR檢測試劑盒

              人八聚體轉(zhuǎn)錄因子(OTF2A)ELISA檢測試劑盒

              鴨源雞桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒

              腦心肌炎病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

              人次黃氧化試劑盒ELISA

              產(chǎn)堿普羅威登斯菌PCR檢測試劑盒

              擠奶工結(jié)節(jié)病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

              α淀粉(AMS/AMY) ELISA Kit

              HiFi One-Step RT-PCR Mix(電泳)溶組織梭狀桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

              牛結(jié)核分歧桿菌(MB)核檢測試劑盒

              人層連蛋白/板層(LN) ELISA Kit

              普通變形桿菌PCR檢測試劑盒



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